Диагностический блок

[18F]CFA в качестве транслируемой пробы ПЭТ-визуализации активности деоксицитидинкиназы. Часть III

[18F]CFA в качестве транслируемой пробы ПЭТ-визуализации активности деоксицитидинкиназы. Часть III

Обсуждение

Мы имеем доказательство, что [18F]CFA является высокоспецифичным субстратом/пробой для dCK с минимальной перекрестной реактивностью с dGK. Накопление [18F]CFA в лейкозных клетках было конкурентно ингибировано зависимым способом от концентрации dC, физиологическим субстратом dCK. Имеются данные о том, что уровни dC в плазме значительно различаются у разных видов, и, что эти изменения соответствуют выраженным различиям биораспределения [18F]CFA у мышей и людей. Соответственно, ПЭТ-исследование с [18F]CFA более чувствительно у людей, чем у мышей, из-за снижения конкуренции между пробой и эндогенным dC. Накопление [18F]CFA лейкозными клетками было dCK-зависимым, и также накопление пробы было чувствительным к вариациям экспрессии dCK. При этом условии значительная вариация экспрессии и активности dCK наблюдалась в группе клеточных линий лимфомы (35). Подобные вариации экспрессии dCK, вероятно, встречаются в других формах рака. Уровни мРНК dCK также возрастают при активации Т-клеток (8). Дополнительные уровни регулирования dCK включают посттрансляционные механизмы. Например, фосфорилирование dCK на Ser-74 увеличивает активность dCK (36). Для катализации фосфатирования dCK (36⇓–38) была предложена ДНК-повреждающая реакция киназы по мутированному гену атаксии-телангиэктазии (АТМ). Если наблюдаемая чувствительность ПЭТ [18F]CFA к изменениям активности dCK будет подтверждена более крупными клиническими исследованиями, это неинвазивное ПЭТ-исследование в реальном времени может обеспечить полезный биомаркер для различных методов лечения, которые вызывают активацию Т-клеток, вызывают повреждение ДНК (36 ), или основываются на dCK-зависимых нуклеозидных аналоговых пролекарствах. В частности, [18F]CFA может быть полезным в качестве фармакокинетического биомаркера ПЭТ-стратификации для соответствующего ему препарата Клофарабин (Клолар; Джензайм) (39). Кроме того, поскольку ингибиторы dCK (5, 6, 25) двигаются в сторону клинических исследований, ПЭТ [18F]CFA может предоставить сопутствующий фармакодинамический биомаркер, чтобы помочь оптимизировать режимы дозирования и планирования.

Учитывая восприимчивость накопления [18F]CFA к конкуренции эндогенными нуклеозидами, использование [18F]CFA у пациентов с повышенными уровнями dN в плазме может приводить к ложноотрицательным снимкам. Такие состояния включают синдром лизиса опухоли, который следует за химиотерапией при гематологических злокачественных опухолях (40), генетические дефекты в пуриновых нуклеозид-катаболизирующих ферментах аденозиндезаминазы (ADA) и пуриновой нуклеозидфосфорилазы (PNP) (41, 42) и лечение определенных лейкозов с ингибиторами ADA и PNP (43, 44). В дополнение к уровню dN в плазме, который должен определяться у каждого пациента, подвергшегося визуализации с [18F]CFA, интерпретация ПЭТ-снимков [18F]CFA также должна учитывать факторы, отличные от dCK, которые могут модулировать накопление пробы. Как концентрирующие, так и уравновешивающие белки-переносчики, а также белки-переносчики АТФ-связывающих кассет (АВС) могли модулировать накопление [18F]CFA в опухолях (45, 46).

Таким образом, эта работа поддерживает оценку [18F]CFA в более крупных клинических исследованиях в качестве сопутствующего биомаркера для нескольких терапевтических подходов. Кроме того, [18F]CFA дополняет набор нуклеозидных аналоговых ПЭТ-проб для визуализации dN-киназ (Рис. 6). Учитывая разнообразные биологические функции и терапевтическую значимость цитозольных и митохондриальных dN киназ, наличие набора проб ПЭТ-визуализации для неинвазивной оценки активности этих ферментов может предоставить широкий спектр доклинических и клинических применений.

Рис. 6.

Существующий набор ПЭТ-проб для метаболизма нуклеотидов. Предлагаемое сопоставление ПЭТ-проб с дезоксирибонуклеозидными киназами. [18F]FLT, 3'- [18F] фтор-3' дезокситимидин (48); 1- [18F]FMAU, 2'-дезокси-2 '- [18F]фтор-5-метил-1-β-1-арабинофуранозилурацил (47, 49); d- [18F]FMAU, 2'-дезокси-2 '- [18F]фтор-5-метил-1-β-d-арабинофуранозирурацил (50, 51). Показаны потенциальные применения этих проб, а также анатомические участки преимущественного накопления у здоровых добровольцев. *, Накопление [18F]FLT в печени отражает глюкуронидирование пробы (52). N.D., не определено; PD, фармакодинамический; PK, фармакокинетический.  **, Накопление [18F]F-AraG также может отражать активность dCK.

Материалы и методы

LC-MS/MS-MRM.

Подробная информация об LC-MS/MS-MRM-анализах представлена во Вспомогательной информации: материалы и методы.

Иммуноблоттинг.

Иммуноблоттинг выполняли, как описано выше (4). Первичные и вторичные антитела представлены во Вспомогательной информации: материалы и методы.

Исследования на животных.

Исследования животных проводились по согласованию с комитетом по гуманному обращению с животными Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и проводились в соответствии с рекомендациями Отдела лабораторных животных. Для экспериментов по ксенотрансплантату опухоли 2 × 106 CEM-EYFP и CEM-CDA ресуспендировали в 100 мкл 50/50 (объем/объем) смеси PBS и матригеля (BD Biosciences) для подкожных инъекции в левое и правое плечо мышей NSG.

Исследование по накоплению в клетках радиоактивных проб.

Исследование накопления проводилось, как описано выше (47). Смотрите подробности в во Вспомогательной информации: материалы и методы.

Исследования микроПЭТ/КТ и ПЭТ/КТ.

МикроПЭТ/КТ-эксперименты проводились, как описано выше (14). Вкратце, предварительно согретым и анестезированным мышам NSG вводили указанные пробы, а ПЭТ и КТ изображения были получены с использованием сканера G8 ПЭТ/КТ (Sofie Biosciences) через 3 часа после инъекции 740 кБк [18F]CFA. Клинические ПЭТ/КТ-исследования были проведены по протоколу Комитета по научным исследованиям радиоактивных препаратов при одобрении экспертных советов Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, как описано ранее (12). Вкратце, 233,1 МБк [18F]CFA вводили клиническим добровольцам. Для здорового добровольца динамическая визуализация выполнялась сразу после инъекции пробы. Для пациента с параганглиомой статическая визуализация проводилось через 35 мин после инъекции пробы.

Дополнительная информация.

Дополнительные экспериментальные подробности описаны во Вспомогательной информации: материалы и методы.


Вспомогательная информация: материалы и методы

Производство плазмид и ретровирусов.

Плазмида pMSCV-hCDA-IRES-EYFP была описана раннее (35). Плазмид pMSCV-hdGK-IRES-EYFP была создана путем введения кодирующей последовательности dGK человека с удаленной аминокислотной последовательностью N-концевой митохондриальной системы (аминокислоты 1-50) в участок множественного клонирования вируса стволовых клеток мыши (MSCV)-IRES-EYFP, как описано выше (47). Плазмида pMSCV-hdCK-IRES-EYFP была получена, как описано выше (9). Амфотропные ретровирусы были получены путем переходной котрансфекции ретровирусной плазмиды вируса мышиных стволовых клеток (MSCV) и плазмиды для упаковки pCL-10A1 в упаковывающие клетки Phoenix-Ampho.

Клеточные линии и условия культивирования.

Клетки CCRF-CEM получили из Американской коллекции типовых культур. Клетки CEM-R были подарком от доктора Маргарет Блэк (Вашингтонский университет, Пулман, Вашингтон). Клетки CEM и CEM-R выращивали в среде RPMI-1640 (Corning) с добавлением 10% (объем/объем) FBS (Omega Scientific) и 2 мМ l-глутамина (Life Technologies). При исследования накопления радиоактивных проб, для минимизации артефактов, вызванных дезоксирибонуклеозидами, присутствующими в регулярных FBS, использовалась среда RPMI-1640 с добавлением 10% (объем/объем) диализированного FBS (Life Technologies). Для создания линий CEM-R-ΔdGK, CEM-R-dCK и CEM-CDA родительские клетки подвергались спинфекции с соответствующими амфотропными ретровирусами и затем сортировали с помощью проточной цитометрии для выделения чистой популяции трансдуцированных клеток.

Иммуноблоттинг.

Иммуноблоттинг выполняли, как описано ранее (4), используя первичные антитела анти-dCK (описанные в ссылке 36), анти-dGK (HPA034766, Sigma-Aldrich), анти-Актин (Sigma-Aldrich) и анти-CDA (SAB1300716 Sigma-Aldrich) со следующими вторичными антителами: к IgG кролика, HRP-связанные (7074, Cell Signaling Technology) и к IgG мыши, HRP-связанный (7076, Cell Signaling Technology). Для обнаружения использовали хемилюминесцентные субстраты (34077 и 34095, ThermoFisher Scientific) и авторадиографическую пленку (Denville).

Исследование накопления радиоактивных проб.

Исследование накопления  радиоактивных проб проводилось, как описано выше (47). Вкратце, 5 × 105 CEM и CEM-R изогенные клетки ресуспендировали в 1 мл среды на лунку в 12-луночных пластинках. После того, как прошел час времени, клетки инкубировали с указанным количеством радиоактивных проб в течение дополнительного часа. Затем клетки собирали и дважды промывали ледяным PBS. Радиоактивность [3H]-меченых проб измеряли бета-счетчиком (Perkin-Elmer), а [18F]-меченых проб – гамма-счетчиком (Packard). Все использованные [3H] -меченные пробы были приобретены у Moravek Biochemicals.

Радиохимический синтез [18F]-меченых проб.

Синтез [18F]CFA, [18F]F-AraG и [18F]ФДГ выполняли, как описано выше (14, 19, 53).

LC-MS/MS-MRM.

Исходные растворы dNs (10 мМ) 13C, 15N- (13C10,15N5-dA, 13C10,15N5-dG, 13C9,15N3-dC и 13C10,15N2-dT, Cambridge Isotope Laboratories) и 15N-меченые (15N5-dA, 15N5-dG, 15N3-dC и 15N2-dT, Cambridge Isotope Laboratories) были приготовлены индивидуально в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранились при -20 °C. Аликвоты исходных растворов 13N, 15N- и 15N-меченных dNs отдельно объединены и разбавлены в метаноле. Образцы плазмы человека были получены из Sigma-Aldrich и от здоровых доноров. Образцы плазмы нечеловекообразных обезьян (NHP) были подарками от д-ра Эндрю Пирса (AstraZeneca, Кембридж, Великобритания). Образцы цельной крови грызунов получали из ретро-орбитального синуса с использованием капиллярных трубок и сразу же центрифугировали (2000 × g, 15 мин) для выделения надосадочного слоя плазмы. К 20 мкл культуральной среды или плазмы добавляли раствор 15N-меченных внутренних стандартов (IS) (60 мкл, 20 нМ 15N-меченных dNs в метаноле/ДМСО, 100/0,0002, об./об.). Смесь интенсивно перемешивали (30 с) и центрифугировали (15000 × g, 10 мин, 4 °C), а затем 60 мкл надосадочного слоя переносили в чистые пробирки для LC-MS/MS-MRM-анализа. С каждой партией биологических образцов была подготовлена серия калибровочных стандартов путем разбавления 10 мМ растворов 13N, 15N-меченных dNs в их средах или плазме из пула контрольных мышей с получением концентраций в диапазоне от 10 нМ до 10 мкМ. К 20 мкл каждого из этих образцов добавляли то же количество IS. Стандарты калибровки обрабатывались одновременно с идентичными биологическими образцами. Двадцать микролитров каждого образца, эквивалентного 5 мкл плазмы или среды, вводились на пористую графитированную углеродную колонку (2,1 × 100 мм, 5 мкм, Hypercarb, Thermo-Scientific), уравновешенную в воде/ацетонитриле/муравьиной кислоте, 95/5/0,2 и элюировали (200 мкл/мин) с увеличением концентрации растворителя В (ацетонитрил/вода/муравьиная кислота, 90/10/0,2, об./об./об: % В/мин/мкл за мин; 0/0/200, 0/5/200, 15/10/200, 15/20/200, 40/21/200, 50/25/200, 100/26/700, 100/30/700, 0/31/700, 0/34/700, 0/35/200). Выходящий поток из колонки был направлен на источник электрораспыления ионов (Agilent Jet Stream), соединенный с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Agilent 6460), работающим в режиме MRM по положительному иону. Интенсивности ионных переходов для различных изотопов регистрировали с использованием ранее оптимизированных условий [исходный m/z (MH+) → фрагмент m/z: dA, 252,1 → 136,1; 15N5-dA, 257,1 → 141,1; 13C10,15N5-dA, 267,1 → 146,1; dG, 268,1 → 152,1; 15N5-dG, 273,1 → 157,1; 13C10,15N5-dG, 283,1 → 162,1; dC, 228,1 → 112,1; 15N3-dC, 231,1 → 115,1; 13C9,15N3-dC, 240,1 → 119,1; dT, 243,1 → 127,1; 15N2-dT, 245,1 → 129,1; и 13C10,15N2-dT, 255,1 → 134,1]. Пиковые области с соответствующим временем удерживания записывались с использованием программного обеспечения, поставляемого изготовителем. Данные калибровочных стандартов использовались для построения калибровочных кривых для каждого dN (ордината, площадь пика 13C10,15N5 dN/пиковая площадь соответствующего IS, ось абсцисс, молярность 13C10,15N5 dN). Молярность каждого немеченного dN в каждом образце рассчитывалась после нормализации к соответствующему внутреннему стандарту путем интерполяции с соответствующей калибровочной кривой.

Статистический анализ.

Данные представлены как средние величины ± среднеквадратическое отклонение. Статистическая значимость определяется двухсторонним t-критерием. Значения P ниже 0,05 рассматривались, как существенные.


Источники:

Автор:
перевод и адаптация - Алексей Левчук
Источник:
http://www.pnas.org/content/113/15/4027
Поделиться:

Возврат к списку