Радиохимия

III. Высокая молярная активность 18F-меченной производной препарата TAK-875 для ПЭТ-визуализации бета-клеток поджелудочной железы.

Анализ метаболитов, меченных радиоактивным изотопом

ВЭЖХ с переключением колонок в анализе контрольных образцов плазмы крови и образцов поджелудочной железы с добавкой аутентичного [18F]7 выявила только один пик, соответствующий неизмененному индикатору (Rt = 5,5 мин) (Рис. 4a-b). Это продемонстрировало, что метод обработки ткани не разрушал и не влиял на радиоактивный индикатор. Других пиков в контрольных образцах обнаружено не было. Через шестьдесят минут после внутривенного введения [18F]7 крысам (n = 4), один меченый гидрофильный метаболит наблюдался в плазме крыс после переключения (Rt = 3,1 мин) на аналитическую ВЭЖХ, в то время как 88% ± 4% от общей радиоактивности были отнесены к неизмененному радиоактивному индикатору (Рис. 4c). В гомогенате поджелудочной железы был обнаружен только неизмененный радиоактивный индикатор (n = 4) (Рис. 4d).

 

Обсуждение

Для получения ((3-[18F]фторопропил) сульфонил)-пропокси-производной препарата TAK-875 ([18F]7) с высокой молярной активностью и чистотой был разработан новый автоматизированный метод, что позволяет проводить оценку in vivo у крыс в качестве потенциального образца FFA-1 для ПЭТ-визуализации β-клеток. Предшественник тозилата 5 и нерадиоактивный стандарт 7 синтезировали, взяв за начало ароматический спирт 1. Промежуточный метаболит тиоэфира 3 получали путем соединения монозащищенного диола 2 с ароматическим спиртом 1 в условиях сочетания по Мицунобу. Удаление силил-защитной группы и окисление тиоэфира осуществляли в одну стадию путем обработки оксоном для получения 4. Радиохимический предшественник 5 получали с помощью введения тозила в 4, как было описано ранее (Bertrand et al. 2016b). Нерадиоактивный стандарт был синтезирован путем фторирования 4 с использованием диоксо-фтора с последующим сложноэфирным гидролизом, опосредованным основанием (Bertrand et al. 2016b). 


Анализ типичных радиоактивных метаболитов при помощи ВЭЖХ с переключением колонок для контроля и экспериментальных образцов.

Рис. 4. Анализ типичных радиоактивных метаболитов при помощи ВЭЖХ с переключением колонок для контроля и экспериментальных образцов. Переключение колонки с загрузки улавливающей колонки на элюирование улавливающей колонки в аналитическую колонку начинается на t = 0 мин. Спектры радиоактивного излучения (синий) и УФ (254 нм, красный) показаны в наложении. а) Контрольная проба плазмы с добавкой [18F]7. b) Контрольный образец поджелудочной железы с добавкой [18F]7. c) 60 минут после инъекции в плазму. d) 60 минут после инъекции в поджелудочную железу.

Radiation

Излучение

Cps

свм

UV

УФ

Nm

нм

Time

Время

Minutes

Минуты


Радиосинтез [18F]7 завершился реакцией нуклеофильного радиофторирования с последующим сложноэфирным гидролизом, опосредованным основанием, в двухэтапном процессе в одном сосуде. Полупрепаративная очистка [18F]7 методом ВЭЖХ была первоначально исследована с применением колонки С18. Наблюдали совместное элюирование радиоактивного индикатора с нерадиоактивным побочным продуктом. Несмотря на усилия, хроматографическое разрешение индикатора от этого побочного продукта не было достигнуто путем корректировки состава подвижной фазы. Масс-спектрометрия с высоким разрешением показала, что идентификатором примеси являлся алкенсодержащий побочный продукт элиминации 8 (Рис. 1). Разрешение [18F]7 из 8 было достигнуто путем применения колонки с обращенной фазой, с использованием пентафторофенила, что позволило получить [18F]7 с высокой чистотой. Проверка ранее описанных взаимосвязей структура-активность и сококристаллическая структура TAK-875/FFA-1 предвидели, что 8 мог потенциально конкурировать с [18F]7 за связывание с FFA-1 (Negoro et al. 2012; Srivastava et al. 2014). Таким образом, удаление 8 увеличит кажущуюся молярную активность конечного продукта и улучшит потенциал для количественной ПЭТ визуализации FFA-1 и массы бета-клеток поджелудочной железы.

Изменение состава [18F]7 проводили с использованием анионообменной смолы. Очищенный пик [18F]7 ВЭЖХ собирали в сосуд, содержащий водное основание, для обеспечения ионизации функциональной группы карбоновых кислот. Из этого раствора смола эффективно захватывает карбоксилатную форму [18F]7. Остаточный растворитель для ВЭЖХ удаляли промыванием водой. Затем радиоактивный индикатор элюировали из смолы подкисленным этанолом, который фильтровали и разводили изотоническим бикарбонатом и солевым раствором. Это эффективно буферизировало pH конечного раствора для инъекций и обеспечивало [18F]7 в качестве концентрированного раствора для инъекций для ПЭТ-исследований на животных.

Динамическая визуализация при помощи микроПЭТ/КТ (с насыщающей дозой препарата TAK-875 или без нее) была проведена на крысах для оценки кинетических характеристик индикатора и потенциала [18F]7 в качестве агента, нацеленного на FFA-1. Снимки показали высокое поглощение индикатора в органах брюшной полости. В то время как поглощение индикатора могло быть обнаружено в ИО поджелудочной железы, снижения удержания индикатора в группе предварительного лечения препаратом TAK-875 обнаружено не было. Это свидетельствует о том, что сигнал от поджелудочной железы изменен вследствие неспецифического связывания в ткани поджелудочной железы. Для того, чтобы дополнительно понять значение этого индикатора в естественных условиях и подтвердить эти результаты, фокус исследования был перенесен на анализ образцов ткани ex vivo.

Исследования биораспределения ex vivo имеют дополнительное преимущество, заключающееся в устранении ошибки, возникающей при получении при помощи микроПЭТ/КТ ИО поджелудочной железы, которая неотличима от окружающих ее органов и тканей у грызунов путем проведения КТ исследования и могла быть оценена только на основе известных анатомических данных (Yin et al. 2015). Эти исследования показали, что уровень поглощения радиоактивного индикатора в жировой клетчатке, костной и мышечной ткани был очень низким. Кроме того, [18F]7 был обнаружен в поджелудочной железе (0,54 ± 0,04 соотношение ткани к крови). Однако насыщение FFA-1 предварительным лечением препаратом TAK-875 не привело к снижению накопления индикаторов в поджелудочной железе, что подтверждено результатами микроПЭТ. Это привело к исследованию образования и присутствия потенциальных метаболитов, меченных радиоактивным изотопом, для того, чтобы охарактеризовать радиоактивный сигнал, который накапливается в поджелудочной железе. Интересно, что анализ радиометаболитов при помощи ВЭЖХ продемонстрировал только наличие неизмененного [18F]7 в поджелудочной железе через 60 минут после инъекции. Образование одного незначительного метаболита было также обнаружено в плазме крови. Вместе с отсутствием накопления радиоактивности в костях в исследованиях по биораспределению, этот результат подтвердил относительно высокую метаболическую стабильность [18F]7 у крыс.

В ходе этой работы было обнаружено, что препарат [3H]TAK-875 демонстрирует высокий уровень связывания вне цели, вероятно, связанный с высокой степенью липофильности молекулы (cLogP = 4.2) (Hellström-Lindahl et al.. 2017). Учитывая сходство [18F]7 с препаратом TAK-875 с точки зрения химической структуры и липофильности (cLogP = 4,58), а также на основе результатов, описанных здесь, можно сделать вывод о том, что неспецифическое связывание [18F]7 в ткани поджелудочной железы нивелирует этот индикатор в качестве количественного агента визуализации FFA-1 in vivo или ex vivo. Следует приступить к дальнейшей разработке нацеленных на FFA-1 радиоактивных индикаторов TAK-875-производной с акцентом на уменьшение нецелевой маркировки в поджелудочной железе и окружающих тканях за счет повышения гидрофильности.

Выводы

Был разработан однореакторный, двухэтапный и полностью автоматизированный процесс для приготовления [18F]7. Применение колонки для ВЭЖХ с использованием пентафторофенила в этом процессе позволило удалить потенциальную конкурентную примесь 8 FFA-1 и улучшить чистоту и наблюдаемую молярную активность конечного продукта. Для проведения быстрого и эффективного изменения состава радиоактивного индикатора в высоких концентрациях была использована концентрированная анионообменная смола, что позволило оценить in vivo [18F]7 в качестве количественного ПЭТ-агента. Результаты микроПЭТ/КТ визуализации и биораспределения показали накопление радиоактивности в поджелудочной железе, хотя специфическое связывание не могло быть обнаружено после исследований насыщения рецептора FFA-1. Анализ радиоактивных метаболитов показал, что [18F]7 является достаточно стабильным, исключая возможность того, что распад являлся фактором, способствующим наблюдаемому неспецифическому связыванию высокой степени. Несмотря на то, что эти результаты позволяют сделать вывод о том, что неспецифическое связывание [18F]7 в поджелудочной железе препятствует возможности измерять специфическое связывание, они являются информативными и служат основой для разработки дальнейших индикаторов ПЭТ для визуализации бета-клеток при помощи ПЭТ на основе FFA-1.

Сокращения

ТМ: точная масса; КТ: компьютерная томография; МО: максимизация ожидания; ЗС: завершение синтеза; ЭРИ: электрораспылительная ионизация; FFA: рецептор свободных жирных кислот; ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография; ВР: высокое разрешение; ВД: введенная доза; ЯМР: ядерный магнитный резонанс; алгоритм OSEM: итеративный алгоритм ожидаемой максимизации упорядоченных подмножеств; ПЭТ: позитронно-эмиссионная томография; РХВ: радиохимический выход; ОИ: область исследования; СО: стандартное отклонение; ОЭКТ: однофотонная эмиссионная компьютерная томография; SUV: стандартизированный уровень накопления; СД2: сахарный диабет II типа; ТГФ: тетрагидрофуран

Благодарственное слово

Авторы выражают благодарность сотрудникам радиохимической и циклотронной платформы Исследовательского центра Медицинского центра при Университете Монреаля и Флер Годетт из Главного фармакокинетического центра, который является профильным центром для точного измерения массы с высоким разрешением Исследовательского центра Медицинского центра при Университете Монреаля.

Доступ к данным и материалам

Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в эту опубликованную статью [и ее дополнительные информационные файлы].

Вклад авторов

Марк Х. Дорнан, Жульен Гислаин, Барри Беделл, Винсент Пойту, Жан Н. ДаСильва разработали исследование; Марк Х. Дорнан, Даниил Петренёв, Хосе-Мэтью Симард и Антонио Алиага провели эксперименты. Марк Х. Дорнан, Даниил Петренёв, Хосе-Мэтью Симард, Антонио Алиага, Гуоминг Сенг, и Жан Н. ДаСильва проанализировали данные; Марк Х. Дорнан и Жан Н. ДаСильва написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Получение одобрения от этических комитетов

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными. Протокол (протокол № IM16029JDSr) был одобрен комитетами по уходу за животными Исследовательского центра при Университете Монреаля и Исследовательского института Медицинского центра при Университете Макгилла.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Сведения об авторах

Марк Х. Дорнан1,2, Даниил Петренёв1, Хосе-Мэтью Симард1, Антонио Алиага3, Гуоминг Сенг3, Жульен Гислаин1, Барри Беделл3, Винсент Пойту1, 4 и Жан Н. ДаСильва1, 2*

1Исследовательский центр Медицинского центра при Университете Монреаля, ул. Сен-Дени 900, Монреаль, Квебек H2X 0A9, Канада.

2Кафедра радиологии, радио-онкологии и ядерной медицины, Университет Монреаля, бульвар Эдуард-Монпетит 2900, Монреаль, Квебек H3T 1A4, Канада.

3Центр трансляции в биологии, Исследовательский институт Медицинского центра при Университете Макгилла, бульвар Декари-Блок Е 1001, Монреаль, Квебек H4A 3J1, Канада.

4Кафедра медицины, Университет Монреаля, бульвар Эдуар-Монпетит 2900, Монреаль, Квебек H3T 1A4, Канада.


Литература

Andralojc K, Srinivas M, Brom M, Joosten L, de Vries IJM, Eizirik DL, et al. Obstacles on the way to the clinical visualisation of beta cells: looking for the Aeneas of molecular imaging to navigate between Scylla and Charybdis. Diabetologia. 2012; 55(5):1247–57. / Андралойк K., Сринивас M., Бром M., Жустен Л., де Ври И. Ж. М., Эйзирик Д. Л., и др. Препятствия на пути к клинической визуализации бета-клеток: поиск Энея молекулярной визуализации для навигации между Сциллой и Харибдой. Журнал «Diabetologia». 2012; 55 (5): 1247-57.

Bertrand R, Hamp I, Brönstrup M, Weck R, Lukacevic M, Polyak A, et al. Synthesis of GPR40 targeting 3H- and 18F-probes towards selective beta cell imaging. J Label Comp Radiopharm. 2016b;59(14):604–10. / Бертран Р., Хэмп I., Бронструп М., Век Р., Лукачевич М., Поляк А. и др. Синтез GPR40, нацеленный на образцы 3H и 18F в направлении селективной визуализации бета-клеток. Журнал «Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals». 2016b; 59 (14): 604-10.

Bertrand R, Wolf A, Ivashchenko Y, Lo M, Scha M. Synthesis and characterization of a promising novel FFAR1/GPR40 targeting fluorescent probe for β-cell imaging. ACS Chem Biol. 2016a;11(6):1745–54. / Бертран Р., Вольф А., Иващенко Ю., Ло М., Ща М. Синтез и характеристика перспективного нового флуоресцентного образца, нацеленного на FFAR1/GPR40, для визуализации бета-клеток. Журнал «ACS Chemical Biology». 2016a; 11 (6): 1745-54.

Briscoe CP, Tadayyon M, Andrews JL, Benson WG, Chambers JK, Eilert MM, et al. The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by medium and long chain fatty acids. J Biol Chem. 2002;278(13):11303–11. / Бриско К. П., Тадайон M., Эндрюс Дж. Л., Бенсон В. Г., Шамберс Дж. К., Эйлерт М. М., и др. Видоспецифический рецептор, сопряжённый с G-белком, GPR40 активируется жирными кислотами со средней и длинной цепью. Журнал «Biological Chemistry». 2002; 278 (13): 11303-11.

Hellström-Lindahl E, Åberg O, Ericsson C, O’Mahony G, Johnström P, Skrtic S, et al. Toward molecular imaging of the free fatty acid receptor 1. Acta Diabetol. 2017;54(7):663–8. / Хеллстром-Линдал Е., Оберг O., Эриксон К., О’Магони Дж., Джонстром П., Скртик С., и др. На пути к молекулярной визуализации рецептора свободной жирной кислоты 1. Журнал «Acta Diabetologia». 2017; 54 (7): 663-8.

Ionescu-Tirgoviste C, Gagniuc PA, Gubceac E, Mardare L, Popescu I, Dima S, et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 2015;5:14634. / Ионеску-Тирговиште К., Гагнюк П. А., Губчак Е., Мардар Л., Попеску И., Дима С. и др. 3D-карта маршрутов по островках здоровой поджелудочной железы человека. Журнал «Scientific Reports». 2015; 5: 14634.

Itoh Y, Kawamata Y, Harada M, Kobayash M, Fuji R, Fukusumi S, et al. Free fatty acids regulate insulin secretion from pancreatic beta-cells through GPR40. Nature. 2003;422:173–6. / Ито Й., Кавамата Й., Гарада M., Кобайаш M., Фуджи Р., Фукусуми С., и др. Свободные жирные кислоты регулируют секрецию инсулина из бета-клеток поджелудочной железы через GPR40. Журнал «Nature». 2003; 422: 173-6.

Kahn SE. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of type 2 diabetes. Diabetologia. 2003;46(1):3–19. / Кан С. Е. Относительный вклад резистентности к инсулину и дисфункции бета-клеток в патофизиологию сахарного диабета 2 типа. Журнал «Diabetologia». 2003; 46 (1): 3-19.

Kenk M, Greene M, Lortie M, Robert A, Beanlands RS, Dasilva JN. Use of a column-switching high-performance liquid chromatography method to assess the presence of specific binding of (R)- and (S)-[11C]rolipram and their labeled metabolites to the phosphodiesterase-4 enzyme in rat plasma and tissues. Nucl Med Biol. 2008;35(4):515–21. / Кенк М., Грин М., Лорти М., Роберт А., Бинлендс Р. С., Дасильва Дж. Н. Использование метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с переключением колонок для оценки наличия специфического связывания (R)- и (S)-[11C]ролипрама и их меченых метаболитов с ферментом фосфодиэстераза-4 в плазме и тканях крыс. Журнал «Nuclear Medicine and Biology». 2008; 35 (4): 515-21.

Mancini AD, Poitout V. GPR40 agonists for the treatment of type 2 diabetes: life after “TAKing” a hit. Diabetes Obes Metab. 2015;17(7):622–9. / Манчини А. Д., Пвату В. Агонисты GPR40 для лечения сахарного диабета 2 типа: жизнь после «принятия» вызова. Журнал «Diabetes, Obesity and Metabolism». 2015; 17 (7): 622-9.

Negoro N, Sasaki S, Mikami S, Ito M, Suzuki M, Tsujihata Y, et al. Discovery of TAK-875: a potent, selective, and orally bioavailable GPR40 agonist. ACS Med Chem Lett. 2010;1(6):290–4. / Негоро Н., Сасаки С., Миками С., Ито М., Сузуки М., Цудзигата Ю., и др. Открытие TAK-875: сильнодействующий, селективный и перорально биодоступный агонист GPR40. Журнал «ACS Medicinal Chemistry Letters». 2010; 1 (6): 290-4.

Negoro N, Sasaki S, Mikami S, Ito M, Tsujihata Y, Ito R, et al. Optimization of (2,3-Dihydro-1-benzofuran-3-yl)acetic acids: discovery of a non-free fatty acid-like, highly bioavailable G protein-coupled receptor 40/free fatty acid receptor 1 agonist as a glucose-dependent Insulinotropic agent. J Med Chem. 2012;55(8):3960–74. / Негоро Н., Сасаки С., Миками С., Ито M., Цудзигата Й., Ито Р., и др. Оптимизация (2,3-дигидро-1-бензофуран-3-ил)уксусные кислоты: открытие подобного к несвободной жирной кислоте, высоко биодоступного рецептора, связанного с G-белком 40/рецептора свободной жирной кислоты 1, в качестве глюкозозависимого инсулинотропного агента. Журнал «Medicinal Chemistry». 2012; 55 (8): 3960-74.

Otieno MA, Snoeys J, Lam W, Ghosh A, Player MR, Pocai A, et al. Fasiglifam (TAK-875): mechanistic investigation and retrospective identification of hazards for drug induced liver injury. Toxicol Sci. 2017;163(2):1–11. / Отьено M. A., Снойс Дж., Лем В., Гош A., Плейер М. Р., Покай A., и др. Фасиглифам (TAK-875): исследование механизма и ретроспективная идентификация опасностей для лекарственного повреждения печени. Журнал «Toxicological Sciences». 2017; 163 (2): 1-11.

Srivastava A, Yano J, Hirozane Y, Kefala G, Gruswitz F, Snell G, et al. High-resolution structure of the human GPR40 receptor bound to allosteric agonist TAK-875. Nature. 2014;513(7516):124–7. / Сривастава А., Яно Дж., Хирозан Ю., Кефала Г., Грусвиц Ф., Снелл Г., и др. Структура с высоким разрешением человеческого рецептора GPR40 связана с аллостерическим агонистом TAK-875. Журнал «Nature». 2014; 513 (7516): 124-7.

Wilke BI, Dornan MH, Yeung J, Boddy CN, Pinto A. Hexanes/acetonitrile : a binary solvent system for the efficient monosilylation of symmetric primary and secondary diols. Tetrahedron Lett. 2014;55(16):2600–2. / Вильке Б. И., Дорнан М. Х., Йенг Дж., Бодди С. Н., Пинто А. Гексаны/ацетонитрил: бинарная система растворителей для эффективного моносилилирования симметричных первичных и вторичных диолов. Журнал «Tetrahedron Letters». 2014; 55 (16): 2600-2.

Yin T, Coudyzer W, Peeters R, Liu Y, Cona MM, Feng Y, et al. Three-dimensional contrasted visualization of pancreas in rats using clinical MRI and CT scanners. Contrast Media Mol Imaging. 2015;10(5):379–87. / Ин T., Коудайзер В., Питерс Р., Лиу Й., Кона M. M., Фенг Й., и др. Трехмерная контрастная визуализация поджелудочной железы у крыс с использованием клинических МРТ- и КТ-сканеров. Журнал «Contrast Media and Molecular Imaging». 2015; 10 (5): 379-87.

Автор:
Mark H. Dornan, Daniil Petrenyov, José-Mathieu Simard, Antonio Aliaga, Guoming Xiong, Julien Ghislain, Barry Bedell, Vincent Poitout and Jean N. DaSilva
Поделиться:

Возврат к списку